赵根龙 董焕程 范 理 （国家饲料质量监督检验中心（北京））

   盐酸氨丙啉化学名1-[（4-氨基-2-丙基-5-嘧啶基）甲基]-2-甲基吡啶氯化物盐酸盐，是一种抗原虫药，用于防治球虫病。盐酸氨丙啉是从1960年开始就被广泛应用的传统抗球虫药，由于高效、安全，不易引起球虫耐药性，在鸡、兔、犊牛、羔羊中均有应用。盐酸氨丙啉多与乙氧酰胺苯甲酯、磺胺喹恶啉等并用，以增强效应。盐酸氨丙啉毒性虽低，但长期高浓度应用能引起雏鸡硫胺缺乏症状，对产蛋鸡则禁用。美国FDA、日本、韩国、加拿大等国家均规定了盐酸氨丙啉在动物组织中的最高残留限量。我国也有相关规定，农业部不仅制定了盐酸氨丙啉在动物组织中的最高残留限量，而且在农牧发[1997]8号文件中明确规定，在鸡配合饲料中盐酸氨丙啉最低用量为62.5g/t，最高用量125.0g/t，盐酸氨丙啉+乙氧酰胺苯甲酯最低用量62.5g/t + 4g/t ，最高用量125.0g/t + 8g/t 。只有制定相应的测定方法，才能有效地进行管理。因此，制定一种简便、快速、准确的测定饲料中盐酸氨丙啉的方法，对规范饲料中盐酸氨丙啉的使用、加强饲料的检测监督、保障国民健康、扩大对外贸易具有十分重要的意义。
    盐酸氨丙啉为白色或类白色粉末，在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚中极微溶解，在氯仿中不溶。对饲料中盐酸氨丙啉的含量测定，国内外有若干检测方法，据资料报道，有紫外分光光度法、荧光光度法、高效液相色谱法等。美国AOAC2000版仍然采用上世纪60年代形成的分光光度法和荧光光度法。AOAC的分光光度法有几个缺点，线形范围窄，空白值高，结果很大程度上取决于用于净化的Al2O3的类型；另外，该分析方法烦琐费时，需使用剧毒的KCN作为显色剂。而荧光光度法则对抗生素会有一定的干扰。高效液相色谱法中又有正相色谱、反相色谱、柱后衍生反相色谱（荧光检测器）及离子对反相色谱法等。由于采用通常的正相和反相色谱，盐酸氨丙啉保留均很弱，无法有效排除复杂的饲料样品的干扰，需进行复杂的净化，烦琐费时。而国外报道的离子对方法虽能很好地解决这一问题，但所用的离子对试剂二辛基硫代琥珀酸钠（DOSS）价格非常昂贵，且需从国外进口。而本方法根据我国的具体情况，使用普遍配备的反相C18柱及紫外检测器，离子对选用价格低廉的国产试剂，而且灵敏度高，不需净化，有很宽的线性范围，检出限低，是一种适合推广使用的简单、快速、灵敏、可靠的分析方法。

    1．测定方法
    1.1原理:饲料样品中的盐酸氨丙啉以含有离子对试剂的甲醇溶液超声提取，离心后过滤，用离子对反相液相色谱法测定。
    1.2试剂和溶液
    除特殊注明外，本法所用的试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水符合GB/T 6682一级用水的规定。
    1.2.1乙腈：色谱纯。
    1.2.2甲醇。
    1.2.3十二烷基磺酸钠。
    1.2.4二乙胺。
    1.2.5冰乙酸。
    1.2.6提取液：称取1.36g十二烷基磺酸钠（1.2.3），溶于适量2+1（V1+V2）的甲醇水溶液中，并用该混合液稀释至1L。
    1.2.7盐酸氨丙啉标准品：纯度99.8%。
    1.2.8盐酸氨丙啉标准溶液
    1.2.8.1盐酸氨丙啉标准储备液：准确称取盐酸氨丙啉标准品（1.2.7）0.0500g，置于100mL容量瓶中，用提取液（1.2.6）溶解并定容至刻度，摇匀，其浓度为500μg/mL，贮于4～6℃冰箱中，有效期一个月。
    1.2.8.2盐酸氨丙啉标准工作液：准确吸取盐酸氨丙啉标准储备液（1.2.8.1）10.00mL，置于50mL容量瓶中，用提取液(1.2.6)溶解并定容至刻度，摇匀，其浓度为100μg/mL。再以此稀释液配置50μg/mL、10μg/mL、5μg/mL的标准工作液。
    1.2.9 HPLC流动相：称取1.09g十二烷基磺酸钠（1.2.3），溶于适量体积分数为30%的乙腈水溶液中，加入3mL二乙胺（1.2.4）和10mL冰乙酸（1.2.5），用体积分数为30%的乙腈水溶液稀释至1L，混匀，用0.45μm滤膜过滤，使用前超声脱气。
    1.3仪器
    1.3.1实验室常用仪器、设备。
    1.3.2分析天平：感量为0.0001g和0.001g各一台。
    1.3.3超声水浴。
    1.3.5离心机：4000 r/min～5000r/min。
    1.3.6高效液相色谱仪：具有紫外或二极管阵列检测器。
    1.4 分析步骤
    1.4.1 提取
    称取饲料样品5g（准确至0.001g），置于50mL离心管中，准确加入提取液（1.2.6）50.00mL，加塞，充分摇动1min，再置超声水浴中超声提取20min，其间用手充分摇动两次。取出后于离心机上4000r/min离心10min ，将上清液用0.45μm滤膜过滤，滤液作为试样液。
    1.4.2测定
    1.4.2.1 HPLC测定参数的设定
    色谱柱：C18柱，柱长150mm，柱内径4.6mm，粒度5μm或性能类似的分析柱。
    柱温：室温。
    检测器：紫外检测器，检测波长267nm。
    流动相流速：1.5mL/min。
    进样量：10～20μL。
    1.4.2.2定量测定
    取适量由7.1获得的样品制备液和相应浓度的盐酸氨丙啉标准工作液（1.2.8.2）进行测定，以色谱峰峰面积做单点校准定量。
    1.4.3结果计算与表述
    分析结果表示为盐酸氨丙啉在饲料中的质量分数X，以毫克每千克（mg/kg）表示,可用公式（1）计算：
         （1）

    式中：
    m1 -HPLC试样色谱峰对应的盐酸氨丙啉质量，单位为微克（μg）；
    m -试样质量，单位为克（g）；
    n - 稀释倍数；

    2. 结果与讨论
    2.1提取条件的确定
    AOAC及国内外许多方法采用甲醇+水（2+1）（V1+V2）作为提取剂，而有报道离子对色谱法采用甲醇+水（2+1）（V1+V2）含0.005mol/L离子对试剂及0.01mol/L的CaCl2作为提取剂，本方法采用甲醇+水（2+1）（V1+V2）含0.005mol/L离子对试剂作为提取剂，不加入CaCl2，因为如加入，提取液将产生沉淀。由于采用震荡方法提取过于耗时，因此采用超声法，提取20min，中间摇动两次。如中间不摇动，回收率在85%左右，而摇动后回收率均超过90%。
    因此，本方法确定的提取条件是5g饲料样品，用50mL提取液振摇1min，然后超声提取20min，超声中再振摇两次。超声后用离心机 4000r/min离心10min，上清液过0.45μm滤膜，备用。
    2.2色谱条件的选择
    2.2.1 色谱类型的选择
    目前，饲料中盐酸氨丙啉的测定有正相色谱、反相色谱、柱后衍生反相色谱（荧光检测器）及离子对反相色谱法等。由于采用通常的正相和反相色谱，盐酸氨丙啉保留均很弱，无法有效排除复杂的饲料样品的干扰，需进行复杂的净化，烦琐费时。而正相色谱更因其不如反相色谱普及，柱后衍生反相色谱需另添昂贵的装置，因此，本研究试用了反相色谱法进行试验，用反相C18柱，结果如下：

         流动相                           流速/(mL/min)    保留时间/min
0.02mol/L磷酸二氢钾+乙腈（60+40）（V1+V2）    1.00       1.4(与溶剂峰重叠)
0.02mol/L磷酸二氢钾+乙腈（90+10）（V1+V2）    1.00             3.8
0.02mol/L磷酸二氢钾+乙腈（95+5）（V1+V2）     0.60             4.62
甲醇+水（20+80）（V1+V2）                     0.60             2.81

    从以上结果来看，盐酸氨丙啉保留时间太短，而饲料样品在此范围有干扰，必须经过烦琐的净化。而在乙腈+水（40+60）的溶液中加入0.004mol/L的离子对试剂十二烷基硫酸钠后，保留时间延长为6.9min左右。因此，确定选用反相离子对色谱法作为测定方法，这样，既可使用反相C18柱及紫外检测器等通用仪器设备，又可不必净化，简单、省时。
    2.2.2 离子对试剂的选择
    据国外资料，离子对试剂使用二辛基硫代琥珀酸钠（DOSS），保留时间长达26.1min(流速为1.00mL/min)，能够有效地在不净化的条件下完成对盐酸氨丙啉的分析，比十二烷基硫酸钠效果更好，但二辛基硫代琥珀酸钠（DOSS）需进口，10g的价格高达1200元左右，因此，考虑到我国的实际情况，又试验了另一种离子对试剂十二烷基磺酸钠，使用流速1.50mL/min，保留时间为16min左右，能够有效地在不净化的条件下避免饲料样品的干扰，而且该试剂价格低廉，效果则与二辛基硫代琥珀酸钠（DOSS）相当。因此，选择十二烷基磺酸钠作为离子对试剂。
    2.2.3 检测波长的选择
    将50μg/mL的盐酸氨丙啉标准液进样，在二极管阵列检测器上扫描，波长为200～400nm，（图1）。结果显示，盐酸氨丙啉在200.5、266.5nm处有较强吸收，我们选定267nm为检测波长。
    2.2.4 流速的选择
    若选择1.0mL/min左右的流速，分析时间过长，而使用1.5mL/min流速，保留时间比较合适，而且此时柱压不太高，若再增加流速则柱压过高，因此，最佳流速为1.5mL/min。
    2.3 方法的性能检验
    2.3.1 标准品的线性范围
    准确移取盐酸氨丙啉标准储备液，用提取液依次稀释，配制成浓度为1、5、10、20、50、100、200μg/mL的标准溶液，根据盐酸氨丙啉的浓度和峰面积的关系，绘制线性关系曲线（图1）。
    测定结果：直线回归方程为Y=-3089+12416X，相关系数r=0.999997，说明盐酸氨丙啉的浓度与峰面积之间具有良好的线性关系，而且有很宽的线性范围。

图1 盐酸氨丙啉不同浓度与峰面积相应值线性关系图

    2.3.2 最低检测浓度
    在实际饲料样品中添加盐酸氨丙啉标准工作液，经提取、离心、过滤，以2～3倍噪音量的信号为准，取样为5g时，最小检出浓度为1.0mg/kg。
    2.3.3 仪器的精密度
    以5μg/mL的盐酸氨丙啉标准工作液，重复进样八次，计算峰面积的变异系数，结果见表1。结果表明，在此色谱条件下，仪器处于良好的分析状态。

                                表1 方法精密度试验结果

    2.3.4 方法的准确度、精密度和适用范围
    为考察方法的准确度、精密度和适用范围，我们在不同的配合饲料中添加不同浓度的盐酸氨丙啉，测得的添加回收率和结果的变异系数列于表2。
    从表中数据可以看出，本方法具有较高的回收率（平均为95.4%）和较好的精密度，而且能适应配合饲料、添加剂预混料和浓缩料中盐酸氨丙啉的测定，由于精料补充料与浓缩料成分相似，因此，也适用于精料补充料，而浓度从5mg/kg到10000mg/kg都有较高的回收率。

                表2 方法对不同饲料样品添加盐酸氨丙啉的测定结果

    2.3.5 方法干扰试验
    由于盐酸氨丙啉多与乙氧酰胺苯甲酯、磺胺喹恶啉等并用，我们用此色谱条件试验了乙氧酰胺苯甲酯、磺胺喹恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶的保留情况，其保留时间见表3。从表中保留时间来看，它们对盐酸氨丙啉无任何干扰。

                   表3 方法干扰实验

    3. 结论
    本法具有很好的准确度和精密度，并能适合配合饲料、预混合饲料、浓缩饲料等各种饲料中盐酸氨丙啉的测定，且操作简便、耗时短、毒性小、检测费用低，具有很高的灵敏度，线性范围宽，回收率高，是一种简单、快速、准确的分析方法。
    主要参考文献
    1.AOAC，《Official Method of Analysis of the Associa?鄄tion of Official Analytical Chemists》,5.1.08 Amprolium in Feeds-Spectrophotometric Method. （其余略）